天津免疫层析法读数仪

来源: 发布时间:2021-03-01

标记:胶体金与蛋白质(IgG)的结合:将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/LK2CO3调pH至9.0,电磁搅拌IgG溶液,加入胶体金溶液,继续搅拌10min,加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入量:5%BSA使溶液终浓度为1%;1%聚乙二醇加至总溶液的1/10.在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的,在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量大。步骤:①用0、1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCl调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。②于100ml金溶胶中加入合适标记量的蛋白质溶液(体积为2~3ml),搅拌2~3分钟。③加入5ml1%PEG20000溶液。④于10000~100000g离心30~60分钟(根据粒径大小选择不同离心条件),小心吸去上清液(切忌倾倒)。⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2~0.5mg/mlPEG20000的缓冲液中,离心沉淀后,再用同一缓冲液恢复,浓度以A1cm/540nm=1.5左右为宜,以0.5mg/ml叠氮钠防腐,置4℃保存。⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于SephadexG-200柱进行凝胶层析分离纯化,以含0.1%BSA的缓冲溶液洗 通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2,以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0 内置多种接口,支持LIS系统。天津免疫层析法读数仪

免疫胶体金的制备1、制备胶体金标记蛋白质应注意的问题(1)蛋白质的预处理。蛋白质应先对低离子强度的水透析,去除盐类成分。用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。(2)低盐浓度的缓冲液。过量盐可使金颗粒发生凝集。(3)当PH接近于蛋白质等电点或略偏碱性。蛋白质所处溶解状态较适合偶联,蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量较大。(4)蛋白质适用量的选择:能使胶体金稳定的合适蛋白量再加10%即为*佳标记蛋白量。(5)胶体金与蛋白质偶联后,加入稳定剂,以避免产生凝集。一般选用PEG(分子量为20000)和牛血清白蛋白作稳定剂。2、常见方法(1)用0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCl调节金溶胶至所需pH。(2)加入*佳标记量的蛋白质溶液,搅拌2~3分钟。(3)加入5ml1%PEG20000溶液。(4)于10000~100000g离心,小心吸去上清液。(5)将沉淀悬浮于一定的缓冲液中,离心沉淀后,再用同一缓冲液恢复,浓度以A1cm/540nm=1.5左右为宜,置4℃保存。天津免疫层析法读数仪采用CMOS扫描技术,测量精度高,比色法测量精度较高。

金标免疫试验的原理将氯金酸(HAuCl4)用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒(胶体金)标记抗体,(或金黄色葡萄球菌A蛋白SPA)。金标为一种催化剂,经还原剂(如对苯二酸)处理,将显影剂中的银离子还原成不溶性金属银,沉淀在每个金颗粒的周围,银沉淀在光镜下可清楚地显示。滴金免疫实验原理同一般免疫斑点实验,也是用已知抗原或抗体包被硝酸纤维素膜,再用金标记抗体或抗原进行快速测定。临床应用的有两种方法:金标一步法(层析法)和金标二步法(斑点渗漏法)。具体讲即用两个人HCG—β单克隆抗体,一个抗体吸附于硝酸纤维素薄膜(NC膜)上,另一抗体结合于金溶胶颗粒表面。尿中HCG先与NC膜上的抗体-结合,然后再与金标单抗溶液反应,形成抗体一HCG一金标抗体的加心式复合物.红色的金斑点.

胶体金法是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,形成带负电的疏水胶溶液,由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金也是免疫电镜技术中较为理想的免疫标记物。胶体金技术具有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点, 因而特别适合于广大基层检验人员以及大批量检测和大面积普查等, 具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。多算法针对性数据拟合,保障了检测的准确性。

用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、酶、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合,因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 免疫金标记技术(Immunogold labelling technique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中,这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大,称之为免疫金银染色。测试质控条,各通道测量结果相对极差≤5%。天津免疫层析法读数仪

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联接机理:研究人员普遍接受的理论为,三种特异的氨基酸残基在金颗粒与蛋白质的联接作用中发挥着重要的作用。而赖氨酸、色氨酸和半胱氨酸这三种氨基酸与胶体金联接的作用机理各不相同。1、赖氨酸带有较强的正电荷,因而自然吸附带负电荷的金颗粒;2、色氨酸主要通过疏水相互作用与胶体金相联接;3、半胱氨酸通过SH-与金表面以共用电子的形式形成配位键。抗体通过这几种作用力与胶体金颗粒牢固、稳定的、不易分离的结合在一起。在很大程度上,标记成功与否取决于上述三种氨基酸残基在被标记蛋白质上的结合位点。在某种情况下,氨基酸联接于蛋白质的活性部位,从而干扰蛋白质的反应活性。空间位阻的限制,当这几种氨基酸残基定位于抗体的抗原结合部位或抗原的特异抗体结合决定簇部位时,可能出现这种类型的干扰。如果被标记的蛋白质分子未做特定的处理就几乎不可能克服这种干扰。为了在免疫检测中获得较好的灵敏,这三种与标记相关氨基酸的正确结合是非常重要的。就标记抗体来说,这三种氨基酸应定位于Fc区,而对于标记抗原,它们应远离抗原的反应决定簇位置。 天津免疫层析法读数仪

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