广东实时荧光定量qPCR实验

荧光阈值(threshold)是以 PCR 反应前 15 个循 环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline), 荧光阈 值的缺省设置是 3 ～ 15 个循环的荧光信号标准差的 10 倍 ,即:Threshold =10SD(cycle 3 ～ 15),一般认 为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的 信号,可以用于定义一个样本的 Ct 值。 Ct 值也称 阈值循环(threshold cy cle),指在 PCR 循环过程中, 荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对 应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达 到设定的阈值时所经历的循环数 。 上海融享生物科技有限公司主做qPCR的。广东实时荧光定量qPCR实验

实时荧光定量 PCR 亦成为 RT-QPCR 的出现，确定了 PCR（聚合酶链）反应的技术实现由了定性检测到兼

定量检测靶标核苷酸序列的华丽变身，是对 PCR 质变式的优化，但是该技术在现实应用中依然存在着大量的难以克服的

障碍：分析溶解曲线的过程耗时很长、标记任意荧光探针的费用昂贵、非特异性的扩增干扰等，长时间来都阻碍着 RT-QPCR

的技术应用。迄今，PCR 中隐含的这些难题的具体机理仍未被彻底弄明白，所以无法从彻底被消除，因此多种优化 PCR

的技巧需要被采纳以推动应用方面和在其有关的领域的研究发展。 广东实时荧光定量qPCR实验那么qPCR的优势都有哪些呢？

分子信标(molecular beacons)是 TaqMan 探针的衍生形式。它是由一种单链 DNA 形成的发夹结构 ,一端标记报告基团, 另一端标记 淬灭基团 , 当形成发夹结构时 , 荧光报告基团与淬 灭基团相互靠近 , 发生 FRET , 当热循环温度达到 分子信标的解链温度时 ,其构象发生改变 , 能与模 板结合而完全伸展成线性分子 , 使 FRET 消失 , 报 告基团发出荧光信号 。与探针互补的模板数量越 多荧光信号越强 , 以此达到定量的目的 。分子信 标特别适用于检测点突变 , 能区分只有一个核苷 酸差异的不同 DNA 序列 ,而且其敏感性远比同等 长度的寡核苷酸探针要高 。

将探针的 TM 值提高 10 ℃ 左右，从而使其能够分辨 1 个碱基的差别，如完全配对则有荧光信号，若有1 个 碱基不匹配则没有信号，而且连在 MGB 分子后面的 是非荧光物质的淬灭基团，从而使这种探针具备更好 的淬灭效果，且无背景荧光、荧光标记灵活、荧光信号

的信噪比高、退火温度高、探针短、核酸多态性( SNP) 识别率高，从而使 TaqmanMGB 探针具备了更加广阔 的应用前景。 上海融享生物科技有限公司qPCR的拥有完善的售后服务。

实时荧光定量 PCR 技术的分类：荧光探针法：水解探针法。水解探针的结构特点是寡核苷酸序列

的 5′端为荧光报告基团，3′端 为 荧 光 淬 灭 基 团。PCR 扩 增

前，探针游离于靶序列外，报告基团发出的荧光被淬灭基团

吸收，检测不到荧光，但有时会因淬灭不彻底，会检测到微

弱的荧光。在 PCR 退火时，探针特异性地结合到靶序列上，

在延伸阶段，利用 Taq 酶 5′-3′外切酶的活性将探针水解，

荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，荧光信号被释放，并与

PCR 产物的数量成正相关。由于水解探针的作用机理依赖

于 Taq 酶 5′-3′外切酶的活性，所以水解探针又称为 Taqman

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分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核 苷酸探针，环部大小为 15 ～ 35 bp，能与靶 DNA 序列 互补，茎部由 GC 含量较高的与靶 DNA 无序列同源

性的互补序列构成，探针的 5'端与 3'端分别标记荧 光报告基团和荧光淬灭基团。当分子信标处于自由

状态时，发夹结构的 2 个末端靠近，使荧光报告基团 与淬 灭 荧 光 基 团 靠 近，产 生 荧 光 共 振 能 量 转 移 ( FRET) 效应，荧光信号被淬灭; 因此，检测不到荧光 信号。当有靶序列存在时，分子信标与靶序列结

合，使分子信标的发夹结构打开呈线型，荧光报告基 团与淬灭基团彼此在空间上产生足够的距离，此时荧

光报告基团不能被淬灭，荧光检测仪器可检测到荧 光。 广东实时荧光定量qPCR实验